怎么构建克隆载体和表达载体?

分类: 教育/科学 >> 科学技术 解析: 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（pla *** id）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完 *** 露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。

一、原理不同1、克隆载体：采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。2、表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。二、要求不同1、克隆载体：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。2、表达载体：常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。三、组成部分不同1、克隆载体：病毒、质粒或高等生物细胞。2、表达载体：目的基因、启动子、终止子、标记基因。参考资料来源：百度百科-表达载体 百度百科-克隆载体

表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。扩展资料：克隆载体对载体的要求：1、能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。2、容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。3、容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。4、容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。5、有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。参考资料来源：百度百科——表达载体参考资料来源：百度百科——克隆载体

用人工方法取得目的基因的适宜载体，即质粒（一种环状双链DNA）或病毒。基因克隆载体必须具备三个条件，具有能使外源DNA片段插入的克隆位点；能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制；必须具有选择标记，以便筛选承载外源DNA的受体细胞。目前原核受体细胞的载体主要有细菌质粒（松弛型）和λ噬菌体两类，真核细胞受体的载体主要有SV40病毒（用于动物转化）和Ti质粒（用于植物转化）。(1)具有自主复制的能力； (2)携带易于筛选的选择标记； (3)含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因的插入； (4)除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖； (5)使用安全，应只存在的宿主，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。

单独一个包含启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般是不容易进入受体细胞的。即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内稳定维持。把能够承载外源基因，并将其带入受体细胞（host：cell）得以稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体（gene：cloning：vector）。作为基因克隆载体一般应该具备以下条件：（1）在克隆载体合适的位置必须含有允许外源DNA片段插入的克隆位点，并且这样的克隆位点应尽可能的多。作为克隆位点的限制性内切核酸酶的识别序列一般在克隆载体上只有一个。为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，克隆载体中往往组装一个含多种限制性内切核酸酶识别序列的多克隆位点（MCS）连杆。（2）克隆载体能携带外源DNA片段（基因），容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好，或能停留在细胞质中进行自我复制；或能整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA同步复制。（3）克隆载体必须含有供选择转化子的标记基因，如根据转化子抗药性升降进行筛选的氨苄青霉素抗性基因（apsuperscriptrsuperscript或ampsuperscriptrsuperscript）、氯霉素抗性基因（cmsuperscriptrsuperscript）、卡那霉素抗性基因（kmsuperscriptrsuperscript或kansuperscriptrsuperscript）、链霉素抗性基因（smsuperscriptsuperscriptsm}}r）、四环素抗性基因（tcsuperscriptrsuperscript或tetsuperscriptrsuperscript）等，根据转化于蓝白颜色进行筛选的β-半乳糖苷酶基因（emphasis：role=italiclacZemphasis），以及表达产物容易观察和检测的报告基因emphasis：role=italicgusemphasis（β-葡萄糖苷酸酶基因）、emphasis：role=italicgfpemphasis（绿色荧光蛋白基因）等。（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。（5）容易插入外来核酸片段，容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作。克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位。目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。目前已构建和应用的基因克隆载体不下几千种，根据构建克隆载体所用的DNA来源可分为质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体以及质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体等。

（1）λ噬菌体克隆载体：λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感染能力。λDNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，全长48502bp。其左右两端各有12个核苷酸组成的5′凸出黏性末端（cohesive：end），而且两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，黏性末端连接成为环状DNA分子。把此末端称为emphasis：role=italiccosemphasis位点（cohesive：end：site）。并且λDNA上约有20kb的区域，约占总长度13的区段对λ噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代，这就是用λDNA构建克隆载体的依据。构建λ噬菌体克隆载体的策略是：①用合适的限制性内切核酸酶切去λDNA上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的1个或2个识别位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效，避免外源DNA片段插入必需区；②若有必要可在非必需区插入选择标记基因；③构建的λDNA载体不应小于36.4kb。（2）λ噬菌体载体的主要类型：λ噬菌体载体分两类，即插入型载体和置换型载体。通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体（insertion：vectors）。由于λ噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体，称为置换型载体。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是923kb，故而该载体主要用来构建基因组文库。λ-DNA作为载体的优点：①λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；②λ-DNA载体的装载能力最大为25kb，超过质粒的装载量；③重组λ-DNA分子的提取和筛选较为方便；④λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。（3）λ噬菌体载体的主要应用：λ噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA片段、构建cDNA文库和基因组文库，并从中筛选目标基因，也可用在大容量载体（如黏粒）中增殖的外源DNA片段和亚克隆。λ噬菌体载体克隆外源DNA片段的原理与质粒载体的工作原理是类似的，只是在形式上有许多差别。载体和外源DNA片段经过酶切以后，外源DNA片段插入到载体的适当位置，或置换载体的填充片段。这种连接后的重组DNA仍保留增殖性能，但由于分子量太大，不能像重组质粒DNA那样可通过转化方法进入大肠杆菌。一般可通过提取λ噬菌体的蛋白质外壳，将在体外重组的噬菌体DNA进行包装，形成噬菌体颗粒。这样的噬菌体颗粒保留对大肠杆菌的感染能力，从而可将被包装的重组噬菌体DNA注射到宿主菌中，通过宿主菌的裂解生长，可增殖重组噬菌体。在构建基因文库时，不同的重组噬菌体DNA经过裂解生长过程最终形成大量的噬菌斑，这些噬菌斑的集合，就构成了基因文库，用λ噬菌体载体构建基因文库时，文库是以噬菌斑的形式存在的，而质粒载体构建的文库是以菌落的形式存在的。λ噬菌体载体用转导法可使1μg重组DNA分子获得10superscript6superscript个以上的噬菌斑，适合用于建立cDNA基因文库，也可用于克隆外源目的基因。

1.不一样2.载体的分类按功能分成：（1）克隆载体:都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。3各自特点克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。4.区别标识是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

基因克隆的步骤：1、获取目的基因；2、将目的基因与载体连接；3、重组体载入受体细胞；4、重组体的筛选、克隆。具体到载体连接这一步，将酶切后的载体与目的片段加入相应的连接体系中就可以了。

1. 质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制 2. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒 3.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性

先加到运载体上，再导入受体细胞。克隆载体是采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，转入受体细胞的方法是先加到运载体上，再导入受体细胞。在载体上插入合适大小的外源DNA片段。

人工染色体载体实际上是一种“穿梭”载体，含有质粒载体所必备的第一受体（大肠杆菌）内源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。这样的载体与目的DNA片段重组后，在第一受体细胞内按质粒复制形式进行高拷贝复制，再转入第二受体细胞，按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的转化子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的转化子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他的克隆载体相比，人工染色体载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段，主要用于构建基因组文库，也可用于基因治疗和基因功能鉴定。目前常用的人造染色体载体有细菌人造染色体（BAC）和酵母人造染色体（YAC）。

质粒（plasmid）是一种寄生于细菌细胞内、独立于染色体外的裸露DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋DNA的形式存在。分子大小差异也很大，小的不足2kb，大的可达100kb以上，多数在10kb左右。在许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均发现含有质粒，并构建了相应的质粒载体。质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体，含有质粒的复制起始位点，能够按质粒复制的形式进行复制。

克隆载体是在克隆过程中用到的各种质粒，比如为了扩增目的基因的高拷贝质粒、为了方便测序的测序质粒、为了连接PCR产物的TA质粒、为了重组的穿梭质粒等等。克隆载体一般有较强的复制能力，利于基因的保存和扩增，而且提供丰富的酶切位点等等。它不必有强启动子，因为不重于表达。表达载体是基因克隆结束后，为了在特定细胞内表达而构建的。他重点在于表达，有各种各样的启动子适应于不同种类的细胞，并且有各种各样，如诱导等可控的表达调控方式。

一、载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因 提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体应具备的条件 1.具有对受体细胞的可转移性 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.长度尽可能小,以提高其载装能力 4.具有多种单一的酶切位点5. 具有合适的选择性标记附图：

一、载体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因 提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件二、载体应具备的条件1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5. 具有合适的选择性标记附图：

克隆载体一般是原核细菌将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接在导入原核细菌内质粒会在原核细菌内大量复制形成大量的基因克隆被克隆的基因不一定会表达但一定被大量复制而表达载体是一些用于工程生产的细菌他们被导入目标基因这些目标基因会在此类细菌中得到表达生产出我们需要的产物导入的基因是有克隆载体产出的

构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为：①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。②测序需要。你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。

表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

克隆载体基本上均来自微生物，主要有三大类:原核生物克隆载体，真核生物克隆载体和人工染色体等。

1.就是能够通过限制性内切酶，将目的DNA片段整合进去，并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA。 常见的有质粒，病毒，噬菌体等2..就是用来连接植入基因的DNA链.3.人工克隆的受精卵所在发育的那个母体.4.就是用来表达植入基因的个体.

条件应该是，与细胞质细胞核要有高度的关联融合性，否则细胞排斥会导致基因移植失败；性质在于，质粒拥有DNA，可以方便将目标基因导入质粒DNA，同时又可以在靶细胞得到表达。

质粒载体、噬菌体载体 理想质粒载体条件：1. 具有复制起始点2. 具有两种以上易被检测的选择性标记3. 在选择标记上具有多种限制酶的单一切点4. 具有尽可能小的相对分子质量5. 应属于松弛复制型6. 应为非传递性质粒理想值粒载体例子：（一） pBR22质粒载体：1. 相对分子质量较小2. 具有一个复制起始点，属松弛复制性载体3. 含四环素抗性和氨苄青霉素抗性基因，便于作为选择性标记4. 有24种单一限制酶识别位点，有利于检测重组转化子（二） pUC质粒载体1. 具有很小的相对分子质量和很高的拷贝数2. 适合用于组织化学方法检测重组体3. 具有多克隆位点MCS区段。可使具两种不同粘性末端的多种外源DNA片段无需借助其它操作而直接定向克隆到pUC质粒载体上。

如何将PCR片段转移到载体多克隆位点之间重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5"磷酸基和3"羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3"端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3"端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。

因为技术达不到啊，如果技术上可行的话，完全可以在染色体水平上进行DNA测序；主要难点在于DNA实在太长了，序列太多了；因而人们要避开这一点，所以就想到了把DNA分解成片断来操作；但是该怎么分解，毕竟单独把一条染色体分解成小的DNA片断也是不合适的，因为DNA含量太小，太难操作；因此，既要保证DNA片断小，又要保证一定的DNA片断浓度。所以，派拉蒙公司发明了一种方法，即取得细胞样品后，提取细胞中的染色体DNA，利用基因枪等等方法把DNA打碎，这样就保证了DNA片断的小以及浓度的高。然后把这些DNA片断连到载体上，而这些DNA片断连到载体上的部位的载体序列（拗口）是已知的，因此，人们可以测出与载体相连的DNA片断的边缘序列是什么，从而使这些不同的DNA片断可以连在一起；同时，DNA片断的内部序列可以在又一轮的打断、连到载体上后进行测序，直到完全测出。直到最后，所有的序列都被测出。这是一项大工程，需要一个大数据库，呵呵。由大化小，又由小得大，妙啊。所以说DNA测序克隆到载体上是为了解决大片断DNA难以直接测定的问题，毕竟一次测定的DNA序列长度是有限的。就这些，呵呵。

载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞,使之传代、扩增、表达的工具.载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等.载体具有能自我复制；有可选择的,便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征.质粒存在于多种细菌,是染色体（核）以外的独立遗传因子,由双链环状DNA组成,几乎完全裸露,很少有蛋白质结合.质粒有严紧型和松弛型之分.严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制,一个细胞可复制1-5个质粒.而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制,一个细胞可复制30-50个质粒,如果用氯霉素可阻止蛋白质合成,使质粒有效利用原料,复制更多的质粒.质粒经过改造品种繁多,常用的有pBR322、pUC系列等.这些质粒都含有多个基本基因,如复制起动区（复制原点Ori）,便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coliLacZ）等,便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列,便于插入的外源基因转录、翻译表达.质粒上还有许多限制性内切酶的切点,即基因插入位点,又叫基因重组位点,基因克隆位点.常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统.噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用.以上载体各有特点,便于选择,灵活应用.

为什么非要先克隆到中间载体上测序可以不同克隆到载体上。dna测序过程，其实是pcr的过程，你只要有足够的模板用于pcr反应就行，不一定要克隆到载体上。当然，大多数都是克隆到载体上，因为你需要将待测dna递交给测序公司，位于载体上的dna可以保存在细菌中，方便运输，也方便测序公司进行扩增（培养菌，提质粒就行了），有时测序是需要重测的，一次不能测完，培养细菌扩增质粒是最简单的方法。

克隆载体是能够通过限制性内切酶,将目的dna片段整合进去,并且能够转入宿主细胞进行表达的生物dna.通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的dna作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源dna片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质.将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖.常见的载体有质粒,噬菌粒,酵母人工染色体.对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力.②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好.③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制.这就要求载体dna上要有合适的限制性核酸内切酶位点.④容易从宿主细胞中分离纯化出来,这才便于重组操作.⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来.

基因克隆的步骤： 1、获取目的基因； 2、将目的基因与载体连接； 3、重组体载入受体细胞； 4、重组体的筛选、克隆. 具体到载体连接这一步,将酶切后的载体与目的片段加入相应的连接体系中就可以了.

答案的两个要点其实就是我们做载体构建两个基本侧略。平末端连接和粘性末端连接。第一种就是采用粘性末端连接的策略。通过在你的平末端目的片段两端分别加上含EcoRI和Xhol的酶切位点的接头序列，然后用这两种内切酶分别对目的片段和载体做双酶切，然后回收酶切后的载体和目的片段并连接。第二种就是采用平末端连接的策略。直接将载体双酶切后然后用DNA聚合酶补平所产生的粘性末端，然后和目的片段直接进行平末端的连接。

在PCR反应中，emphasis：role=italicTaqemphasis酶通常会在延伸的PCR产物3′末端加上一个非配对的碱基A。根据这一特性研制出了一种线性质粒，其5′端各带一个不配对的碱基T。采用这样的质粒可将PCR产物以TA配对连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体被称为T-克隆载体，它的出现使PCR产物的克隆更加简便快捷。如pGEM-3Z4Z载体由pUC1819增加了一些功能片段改造而来，大小为2.74kb。与pUC1819相比，在多克隆位点的两端添加了噬菌体的转录启动子，如Sp6和T7噬菌体的启动子（link：xlinkhref=i010801图4-8link），便于克隆片段的测序。pGEM-3Z和pGEM-4Z的差别在于二者互换了两个启动子的位置。脱氧胸腺嘧啶核苷（T）容易与其他碱基发生非特异性配对，而且T-克隆载体也容易同反应系统中残留的引物或不完整的PCR扩增片段连接。相比之下，UA配对具有更高的特异性。因此研制出一种5′端带一个不配对碱基U的线性质粒，即U-克隆载体。

　　克隆载体：大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制.表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等）,是目的基因能够表达的载体.克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆.但不具备表达元件.而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子（T7）,调节子（LacZ）等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的,防止渗漏表达.是否含有表达系统元件,即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志.

基因载体是携带目的基因、实现目的基因无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的DNA分子。分为克隆载体和表达载体。可用做基因载体的有：质粒DAN、噬菌体DNA和病毒DNA。克隆载体应具备以下基本特征：自我复制能力、具有筛选标志基因和多个限制性核酸内切酶的单一位点等。表达载体除具有以上特征外，还应具有启动子等转录调控序列、适当的翻译控制序列、合理设计的多克隆位点等。

病毒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA（或RNA）复制和外壳蛋白的合成，实现病毒颗粒的增殖。人们利用这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体。把感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体。下面仅简单介绍几种常用的病毒（噬菌体）克隆载体。

就是能够通过限制性内切酶，将目的DNA片段整合进去，并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA。常见的有质粒，病毒，噬菌体等。

基因克隆载体通常是由DNA改造而来的。载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。介绍基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。

克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。

表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。扩展资料：克隆载体对载体的要求：1、能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。2、容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。3、容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。4、容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。5、有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。参考资料来源：百度百科——表达载体参考资料来源：百度百科——克隆载体

克隆载体是能够通过限制性内切酶，将目的DNA片段整合进去，并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA。 通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。 对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。

表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。扩展资料：克隆载体对载体的要求：1、能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。2、容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。3、容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。4、容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。5、有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。参考资料来源：百度百科——表达载体参考资料来源：百度百科——克隆载体

用人工方法取得目的基因的适宜载体，即质粒（一种环状双链DNA）或病毒。基因克隆载体必须具备三个条件，具有能使外源DNA片段插入的克隆位点；能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制；必须具有选择标记，以便筛选承载外源DNA的受体细胞。目前原核受体细胞的载体主要有细菌质粒（松弛型）和λ噬菌体两类，真核细胞受体的载体主要有SV40病毒（用于动物转化）和Ti质粒（用于植物转化）。

一、原理不同1、克隆载体：采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。2、表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。二、要求不同1、克隆载体：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。2、表达载体：常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。三、组成部分不同1、克隆载体：病毒、质粒或高等生物细胞。2、表达载体：目的基因、启动子、终止子、标记基因。参考资料来源：百度百科-表达载体 百度百科-克隆载体

克隆载体是能够通过限制性内切酶,将目的DNA片段整合进去,并且能够转入宿主细胞进行表达的生物DNA。通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源DNA片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质.将重组后的载体引入到宿主细胞中,并在宿主细胞中大量繁殖.常见的载体有质粒,噬菌粒,酵母人工染色体。对载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖,而且最好要有较高的自主复制能力.②容易进入宿主细胞,而且进入效率越高越好.③容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制.这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点.④容易从宿主细胞中分离纯化出来,这才便于重组操作.⑤有容易被识别筛选的标志,当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。

质粒、基因发动子、噬菌体载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。

1.不一样 2.载体的分类 按功能分成： （1）克隆载体:都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增.它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体. （2）表达载体 :具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体. 3各自特点 克隆载体：大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制.克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作. 表达载体：有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的.表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子. 4.区别标识 是否含有表达系统元件,即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志.

基因克隆的步骤：1、获取目的基因；2、将目的基因与载体连接；3、重组体载入受体细胞；4、重组体的筛选、克隆。具体到载体连接这一步，将酶切后的载体与目的片段加入相应的连接体系中就可以了。

现在表达载体用得最多的就是pET载体，该载体带有组氨酸标签，上面的基本元件也比较全，而且还可以根据自己的需要加或减序列克隆载体则如楼上所说以TA载体为主

一、原理不同1、克隆载体：采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。2、表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。二、要求不同1、克隆载体：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。2、表达载体：常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。三、组成部分不同1、克隆载体：病毒、质粒或高等生物细胞。2、表达载体：目的基因、启动子、终止子、标记基因。参考资料来源：百度百科-表达载体 百度百科-克隆载体

表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。扩展资料：克隆载体对载体的要求：1、能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。2、容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。3、容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。4、容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。5、有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。参考资料来源：百度百科——表达载体参考资料来源：百度百科——克隆载体

1.不一样2.载体的分类按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体 :具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。3各自特点克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。4.区别标识 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

克隆载体是在克隆过程中用到的各种质粒，比如为了扩增目的基因的高拷贝质粒、为了方便测序的测序质粒、为了连接PCR产物的TA质粒、为了重组的穿梭质粒等等。克隆载体一般有较强的复制能力，利于基因的保存和扩增，而且提供丰富的酶切位点等等。它不必有强启动子，因为不重于表达。表达载体是基因克隆结束后，为了在特定细胞内表达而构建的。他重点在于表达，有各种各样的启动子适应于不同种类的细胞，并且有各种各样，如诱导等可控的表达调控方式。