克隆

一、载体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因 提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件二、载体应具备的条件1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5. 具有合适的选择性标记附图：

一、载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因 提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体应具备的条件 1.具有对受体细胞的可转移性 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.长度尽可能小,以提高其载装能力 4.具有多种单一的酶切位点5. 具有合适的选择性标记附图：

克隆载体是在克隆过程中用到的各种质粒，比如为了扩增目的基因的高拷贝质粒、为了方便测序的测序质粒、为了连接PCR产物的TA质粒、为了重组的穿梭质粒等等。克隆载体一般有较强的复制能力，利于基因的保存和扩增，而且提供丰富的酶切位点等等。它不必有强启动子，因为不重于表达。表达载体是基因克隆结束后，为了在特定细胞内表达而构建的。他重点在于表达，有各种各样的启动子适应于不同种类的细胞，并且有各种各样，如诱导等可控的表达调控方式。

质粒（plasmid）是一种寄生于细菌细胞内、独立于染色体外的裸露DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋DNA的形式存在。分子大小差异也很大，小的不足2kb，大的可达100kb以上，多数在10kb左右。在许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均发现含有质粒，并构建了相应的质粒载体。质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体，含有质粒的复制起始位点，能够按质粒复制的形式进行复制。

人工染色体载体实际上是一种“穿梭”载体，含有质粒载体所必备的第一受体（大肠杆菌）内源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。这样的载体与目的DNA片段重组后，在第一受体细胞内按质粒复制形式进行高拷贝复制，再转入第二受体细胞，按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的转化子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的转化子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他的克隆载体相比，人工染色体载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段，主要用于构建基因组文库，也可用于基因治疗和基因功能鉴定。目前常用的人造染色体载体有细菌人造染色体（BAC）和酵母人造染色体（YAC）。

先加到运载体上，再导入受体细胞。克隆载体是采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，转入受体细胞的方法是先加到运载体上，再导入受体细胞。在载体上插入合适大小的外源DNA片段。

1. 质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制 2. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒 3.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性

基因克隆的步骤：1、获取目的基因；2、将目的基因与载体连接；3、重组体载入受体细胞；4、重组体的筛选、克隆。具体到载体连接这一步，将酶切后的载体与目的片段加入相应的连接体系中就可以了。

1.不一样2.载体的分类按功能分成：（1）克隆载体:都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。3各自特点克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。4.区别标识是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。

（1）λ噬菌体克隆载体：λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感染能力。λDNA在噬菌体中以线状双链DNA分子存在，全长48502bp。其左右两端各有12个核苷酸组成的5′凸出黏性末端（cohesive：end），而且两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，黏性末端连接成为环状DNA分子。把此末端称为emphasis：role=italiccosemphasis位点（cohesive：end：site）。并且λDNA上约有20kb的区域，约占总长度13的区段对λ噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代，这就是用λDNA构建克隆载体的依据。构建λ噬菌体克隆载体的策略是：①用合适的限制性内切核酸酶切去λDNA上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的1个或2个识别位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效，避免外源DNA片段插入必需区；②若有必要可在非必需区插入选择标记基因；③构建的λDNA载体不应小于36.4kb。（2）λ噬菌体载体的主要类型：λ噬菌体载体分两类，即插入型载体和置换型载体。通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体（insertion：vectors）。由于λ噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体，称为置换型载体。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是923kb，故而该载体主要用来构建基因组文库。λ-DNA作为载体的优点：①λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；②λ-DNA载体的装载能力最大为25kb，超过质粒的装载量；③重组λ-DNA分子的提取和筛选较为方便；④λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。（3）λ噬菌体载体的主要应用：λ噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA片段、构建cDNA文库和基因组文库，并从中筛选目标基因，也可用在大容量载体（如黏粒）中增殖的外源DNA片段和亚克隆。λ噬菌体载体克隆外源DNA片段的原理与质粒载体的工作原理是类似的，只是在形式上有许多差别。载体和外源DNA片段经过酶切以后，外源DNA片段插入到载体的适当位置，或置换载体的填充片段。这种连接后的重组DNA仍保留增殖性能，但由于分子量太大，不能像重组质粒DNA那样可通过转化方法进入大肠杆菌。一般可通过提取λ噬菌体的蛋白质外壳，将在体外重组的噬菌体DNA进行包装，形成噬菌体颗粒。这样的噬菌体颗粒保留对大肠杆菌的感染能力，从而可将被包装的重组噬菌体DNA注射到宿主菌中，通过宿主菌的裂解生长，可增殖重组噬菌体。在构建基因文库时，不同的重组噬菌体DNA经过裂解生长过程最终形成大量的噬菌斑，这些噬菌斑的集合，就构成了基因文库，用λ噬菌体载体构建基因文库时，文库是以噬菌斑的形式存在的，而质粒载体构建的文库是以菌落的形式存在的。λ噬菌体载体用转导法可使1μg重组DNA分子获得10superscript6superscript个以上的噬菌斑，适合用于建立cDNA基因文库，也可用于克隆外源目的基因。

首先根据你的实验需要选择相应的载体 其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点,切记在载体上所选择的酶切位点要和你的基因序列上相一致,并且这两个酶切位点在你的基因序列中并不存在,否则会将基因切断 再次就是对基因和载体进行酶切了,基因要是直接用带有酶切位点的引物进行PCR的话就不用再酶切了.酶切之后进行连接,一般都有连接试剂盒的. 最后的重组质粒要转化至大肠杆菌中进行扩增,然后提取这个质粒进行酶切鉴定.

单独一个包含启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般是不容易进入受体细胞的。即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内稳定维持。把能够承载外源基因，并将其带入受体细胞（host：cell）得以稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体（gene：cloning：vector）。作为基因克隆载体一般应该具备以下条件：（1）在克隆载体合适的位置必须含有允许外源DNA片段插入的克隆位点，并且这样的克隆位点应尽可能的多。作为克隆位点的限制性内切核酸酶的识别序列一般在克隆载体上只有一个。为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，克隆载体中往往组装一个含多种限制性内切核酸酶识别序列的多克隆位点（MCS）连杆。（2）克隆载体能携带外源DNA片段（基因），容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好，或能停留在细胞质中进行自我复制；或能整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA同步复制。（3）克隆载体必须含有供选择转化子的标记基因，如根据转化子抗药性升降进行筛选的氨苄青霉素抗性基因（apsuperscriptrsuperscript或ampsuperscriptrsuperscript）、氯霉素抗性基因（cmsuperscriptrsuperscript）、卡那霉素抗性基因（kmsuperscriptrsuperscript或kansuperscriptrsuperscript）、链霉素抗性基因（smsuperscriptsuperscriptsm}}r）、四环素抗性基因（tcsuperscriptrsuperscript或tetsuperscriptrsuperscript）等，根据转化于蓝白颜色进行筛选的β-半乳糖苷酶基因（emphasis：role=italiclacZemphasis），以及表达产物容易观察和检测的报告基因emphasis：role=italicgusemphasis（β-葡萄糖苷酸酶基因）、emphasis：role=italicgfpemphasis（绿色荧光蛋白基因）等。（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。（5）容易插入外来核酸片段，容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作。克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位。目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。目前已构建和应用的基因克隆载体不下几千种，根据构建克隆载体所用的DNA来源可分为质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体以及质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体等。

用人工方法取得目的基因的适宜载体，即质粒（一种环状双链DNA）或病毒。基因克隆载体必须具备三个条件，具有能使外源DNA片段插入的克隆位点；能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制；必须具有选择标记，以便筛选承载外源DNA的受体细胞。目前原核受体细胞的载体主要有细菌质粒（松弛型）和λ噬菌体两类，真核细胞受体的载体主要有SV40病毒（用于动物转化）和Ti质粒（用于植物转化）。(1)具有自主复制的能力； (2)携带易于筛选的选择标记； (3)含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因的插入； (4)除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖； (5)使用安全，应只存在的宿主，在体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。

表达载体和克隆载体的区别：1、性质不同表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。2、组成不同表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。扩展资料：克隆载体对载体的要求：1、能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。2、容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。3、容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。4、容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。5、有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。参考资料来源：百度百科——表达载体参考资料来源：百度百科——克隆载体

一、原理不同1、克隆载体：采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。2、表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。二、要求不同1、克隆载体：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。2、表达载体：常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。三、组成部分不同1、克隆载体：病毒、质粒或高等生物细胞。2、表达载体：目的基因、启动子、终止子、标记基因。参考资料来源：百度百科-表达载体 百度百科-克隆载体

分类: 教育/科学 >> 科学技术 解析: 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（pla *** id）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完 *** 露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。

肯定可以,只是没有被允许克隆克隆技术即无性繁殖技术。通常的有性生殖是由雌雄交配，精子和卵子结合发育成胚胎，经妊娠后产出新的个体。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。 克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。 英国科学家培育出克隆羊“多莉”，震撼了世界。但是，科学家对克隆技术的认识远没有完结。他们普遍认为，克隆技术还存在很大风险。截止目前，已有越来越多的证据表明，克隆健康的动物远比想象的更为困难。这不能不令人担心动物克隆技术的安全性问题。 3月25日美国各大媒体援引科学家的话说，现有克隆动物技术已经出现许多严重问题，包括克隆动物发育迟缓、心肺存在缺陷、免疫系统功能不健全等。一些从事动物克隆技术研究的专家以及生物学家在接受媒体采访时表示，克隆技术安全性风险并不在于某个特定的程序或是克隆动物发育出现错误，而在于克隆技术过程似乎会使个别基因的表达出现差错，这些差错在生命发展过程中将造成一些无法逆转的问题。尤其严重的是，动物每次克隆过程均无法避免基因变异问题。科学家进一步解释说，动物克隆技术是将成年动物的体细胞，植入一个已经被去掉细胞核的卵细胞中，卵细胞会重新复制原成年细胞的基因，并使其控制胚胎发育，进而借腹形成胎儿，最后诞生一个基因与原提供细胞的动物完全相同的新生命。科学家认为，没有人知道卵细胞如何重新复制原成年细胞的基因，这是克隆技术可能出错的关键原因。 美国麻省理工学院的生物学家罗特夫·詹里斯说，在自然情况下，精子必须经过几个月才能成熟，期间其基因功能也会重新“设定”，卵细胞也会经历类似过程。这一过程必须完美无缺，否则个别基因将会出错，导致后代发育畸形。 与自然生殖过程相比，克隆过程中的卵细胞必须在几分钟或数小时内，完成通常要花几个月或几年才能完成的“任务”。有关分子生物学的试验显示，克隆技术人为地加快动物自然生殖过程，在很多基因复制时出现微妙的错误，造成胚胎停止发育或因克隆动物的基因变异，而在其诞生后产生许多生理问题。科学家表示，“多莉”羊是克隆技术的一个特例，并不代表克隆技术安全或是没有风险。此前，科学家曾取消对克隆动物会过早衰老的担心。“多莉”羊目前生长健康，但科研人员还是不得不将它与其他羊分开饲养，并帮助它“减肥”。继“多莉”羊后，克隆鼠、克隆牛、克隆猪等先后问世，甚至克隆鼠出现第6代复制品。首次克隆出老鼠的美国夏威夷大学生物学家柳町隆造曾表示，一些克隆鼠生长过快，变成肥胖鼠，或是通常肺发育不正常。美国得州A－M大学的克隆专家韦斯金说，克隆牛诞生时常出现心、肺发育缺陷问题。更为关键的是，目前的克隆技术引发的安全性问题还在于克隆技术成功率低。科学家表示，目前整个动物克隆技术的平均成功率不到3％。克隆牛的成功率只有1％。柳町隆造说，虽然克隆鼠的培育率相对高一些，但由于克隆胚胎经常出现遗传发育问题，其成活率很低，只有2％－3％。目前的克隆动物技术使人对其安全性心有余悸，而此前个别科学家提出利用现有克隆技术来克隆人，可能会发生何种情况，更是令人不寒而栗。虽然目前克隆人引起的争议主要集中在伦理道德方面，但科学家指出，真正的问题是在于克隆人可能会出现基因变异，导致克隆人出现致命的生理问题。正像詹里斯博士所说：“克隆人是不顾后果的、不负责任的行为。” 克隆技术研究现状 一、克隆的早期研究 克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。 目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。 采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。 从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。 哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。 二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响 以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。 在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。 三、近3年来克隆研究的重要成果 克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。 此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。 在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。 四、克隆技术的应用前景 克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。 五、克隆技术存在的问题 尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。 此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。 即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。 除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。不断有人在评论克隆，可又有几人真正了解呢？要不是学校举行辩论，我会一直以为就象科幻片里说的那样，现在本人认为，克隆技术是好的，但克隆人却要不得，然而即使制定了法律禁止克隆人，也未必就有效，科学狂人太多了，它自身的利用价值也太大了！

克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。 目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。 采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。 从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。 哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响 以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。 在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。三、近3年来克隆研究的重要成果 克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。 此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。 在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。四、克隆技术的应用前景 克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。五、克隆技术存在的问题 尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。 此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。 即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。 除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。分享给你的朋友吧：人人网新浪微博开心网MSNQQ空间对我有帮助

克隆技术的利 1．克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2．克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3．克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 克隆技术的弊 在理论上，克隆技术还很不成熟；在实践中，克隆动物的成功率还很低，生出的部分个体表现出生理或免疫缺陷，而且动物的残废率相当高并伴有早衰现象等。此外，克隆技术（尤其是人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对词的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。我认为，克隆技术的巨大理论意义和实用价值在于它促使科学家们加快了研究的步伐，使克隆技术的研究与开发进入一个高潮，从而更好地为人类造福。 关于人的： 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。然而，克隆技术也存在着一些弊端。在理论上，克隆技术还很不成熟；在实践中，克隆动物的成功率还很低，生出的部分个体表现出生理或免疫缺陷，而且动物的残废率相当高并伴有早衰现象等。此外，克隆技术（尤其是人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对词的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。我认为，克隆技术的巨大理论意义和实用价值在于它促使科学家们加快了研究的步伐，使克隆技术的研究与开发进入一个高潮，从而更好地为人类造 一是生态层面，克隆技术导致的基因复制，会威胁基因多样性的保持，生物的演化将出现一个逆向的颠倒过程，即由复杂走向简单，这对生物的生存是极为不利的。二是文化层面，克隆人是对自然生殖的替代和否定，打破了生物演进的自律性，带有典型的反自然性质。与当今正在兴起的祟尚天人合一、回归自然的基本文化趋向相悖。三是哲学层面，通过克隆技术实现人的自我复制和自我再现之后，可能导致人的身心关系的紊乱。人的不可重复性和不可替代性的个性规定因大量复制而丧失了唯一性，丧失了自我及其个性特征的自然基础和生物学前提。 一是血缘生育构成了社会结构和社会关系。为什么不同的国家、不同的种族几乎都反对克隆人，原因就是这是另一种生育模式，现在单亲家庭子女教育问题备受关注，就是关注一个情感培育问题，人的成长是在两性繁殖、双亲抚育的状态下完成的，几千年来一直如此，克隆人的出现，社会该如何应对，克隆人与被克隆人的关系到底该是什么呢?二是身份和社会权利难以分辨。假如有一天，突然有20个儿子来分你的财产，他们的指纹、基因都一样，该咋办?是不是要像汽车挂牌照一样在他们额头上刻上克隆人川A0001、克隆人川A0002之类的标记才能识别。第三，支持克隆人的人有一个观点：解决无法生育的问题。但一个没有生育能力的人克隆的下一代还会没有生育能力。你自认为优秀，可克隆出的人除血型、相貌、指纹、基因和你一样外，其性格、行为可能完全不同，你能保证克隆人会和你一样优秀而不误入歧途吗?在克隆人研究中，如果出现异常，有缺陷的克隆人不能像克隆的动物随意处理掉，这也是一个麻烦。因此在目前的环境下，不仅是观念、制度，包括整个社会结构都不知道怎么来接纳克隆人。” 克隆技术在短期内会造福人类，但是终将给人类带来灾难。造福体现在器官培养，可以救治肢残或患其它疾病者；并且可以复制出去世亲人体现哀思。但是克隆技术如果用于复制人，就是人类精神和物质上的双重灾难，精神上人类的伦理道德将被破坏，身体上克隆技术具有未知的问题，可能会引起几代后的人的基因变异。更严重的是长大后的基因人也是人，也受法律保护，他们自由婚恋的权力必将受宪法保护，他们的后代将混入人群，如果若干代后从社会学角度，将会将克隆人的基因传至全世界，一旦发生未知变化，人类将面临灭亡。 好处：可以治病救人 坏处：容易被别有用心的人利用造成极坏的影响，有悖于伦理道德 克隆器官可以在医学上给人类带来希望， 可是如果去克隆人的话： 1.会引起人类的大恐慌，因为有关可怕的克隆人的电影早已把克隆人妖魔化了； 2.会引发道德伦理上的大讨论，因为奶奶的克隆体可能比孙子还小； 3.会引起另一种歧视，因为据说克隆人除非发生基因突变，或者被引入了其他基因从而变成了转基因超人，不然是不会比人更强的。 好处：能为人类做事。 坏处：如果克隆出比人类还聪明的，有思想的人类将面临灭亡！ 好事.让失去的亲人复活,其他的事不管了

克隆技术神奇在哪 1.不经过两性细胞结合而繁殖 2.可以根据需要培育出优质.高产的粮食,蔬菜新品种!可以挽救濒危物种! 3.制造人体配件或是克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中,利用微电流刺激等使两者融合为一体,然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎,当胚胎发育到一定程度后,再被植入动物子宫中使动物怀孕,便可产下与提供细胞者基因相同的动物.这一过程中如果对供体细胞进行基因改造,那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化.

1、克隆技术可解除那些不能成为母亲的女性的痛苦。2、克隆实验的实施促进了遗传学的发展，为“制造”能移植于人体的动物器官开辟了前景。3、克隆技术也可用于检测胎儿的遗传缺陷。将受精卵克隆用于检测各种遗传疾病，克隆的胚胎与子宫中发育的胎儿遗传特征完全相同。坏处：1、克隆将减少遗传变异，通过克隆产生的个体具有同样的遗传基因，同样的疾病敏感性，一种疾病就可以毁灭整个由克隆产生的群体。 可以设想，如果一个国家的牛群都是同一个克隆产物，一种并不严重的病毒就可能毁灭全国的畜牧业。2、克隆技术的使用将使人们倾向于大量繁殖现有种群中最有利用价值的个体，而不是按自然规律促进整个种群的优胜劣汰。从这个意义上说，克隆技术干扰了自然进化过程.3、克隆技术是一种昂贵的技术，需要大量的金钱和生物专业人士的参与，失败率非常高。多利就是277次实验唯一的成果。虽然现在发展出了更先进的技术，成功率也只能达到2-3%。4、转基因动物提高了疾病传染的风险。例如，如果一头生产药物牛奶的牛感染了病毒，这种病毒就可能通过牛奶感染病人

克隆技术即无性繁殖技术。通常的有性生殖是由雌雄交配，精子和卵子结合发育成胚胎，经妊娠后产出新的个体。克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。 克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。 英国科学家培育出克隆羊“多莉”，震撼了世界。但是，科学家对克隆技术的认识远没有完结。他们普遍认为，克隆技术还存在很大风险。截止目前，已有越来越多的证据表明，克隆健康的动物远比想象的更为困难。这不能不令人担心动物克隆技术的安全性问题。 3月25日美国各大媒体援引科学家的话说，现有克隆动物技术已经出现许多严重问题，包括克隆动物发育迟缓、心肺存在缺陷、免疫系统功能不健全等。一些从事动物克隆技术研究的专家以及生物学家在接受媒体采访时表示，克隆技术安全性风险并不在于某个特定的程序或是克隆动物发育出现错误，而在于克隆技术过程似乎会使个别基因的表达出现差错，这些差错在生命发展过程中将造成一些无法逆转的问题。尤其严重的是，动物每次克隆过程均无法避免基因变异问题。科学家进一步解释说，动物克隆技术是将成年动物的体细胞，植入一个已经被去掉细胞核的卵细胞中，卵细胞会重新复制原成年细胞的基因，并使其控制胚胎发育，进而借腹形成胎儿，最后诞生一个基因与原提供细胞的动物完全相同的新生命。科学家认为，没有人知道卵细胞如何重新复制原成年细胞的基因，这是克隆技术可能出错的关键原因。 美国麻省理工学院的生物学家罗特夫·詹里斯说，在自然情况下，精子必须经过几个月才能成熟，期间其基因功能也会重新“设定”，卵细胞也会经历类似过程。这一过程必须完美无缺，否则个别基因将会出错，导致后代发育畸形。 与自然生殖过程相比，克隆过程中的卵细胞必须在几分钟或数小时内，完成通常要花几个月或几年才能完成的“任务”。有关分子生物学的试验显示，克隆技术人为地加快动物自然生殖过程，在很多基因复制时出现微妙的错误，造成胚胎停止发育或因克隆动物的基因变异，而在其诞生后产生许多生理问题。科学家表示，“多莉”羊是克隆技术的一个特例，并不代表克隆技术安全或是没有风险。此前，科学家曾取消对克隆动物会过早衰老的担心。“多莉”羊目前生长健康，但科研人员还是不得不将它与其他羊分开饲养，并帮助它“减肥”。继“多莉”羊后，克隆鼠、克隆牛、克隆猪等先后问世，甚至克隆鼠出现第6代复制品。首次克隆出老鼠的美国夏威夷大学生物学家柳町隆造曾表示，一些克隆鼠生长过快，变成肥胖鼠，或是通常肺发育不正常。美国得州A－M大学的克隆专家韦斯金说，克隆牛诞生时常出现心、肺发育缺陷问题。更为关键的是，目前的克隆技术引发的安全性问题还在于克隆技术成功率低。科学家表示，目前整个动物克隆技术的平均成功率不到3％。克隆牛的成功率只有1％。柳町隆造说，虽然克隆鼠的培育率相对高一些，但由于克隆胚胎经常出现遗传发育问题，其成活率很低，只有2％－3％。目前的克隆动物技术使人对其安全性心有余悸，而此前个别科学家提出利用现有克隆技术来克隆人，可能会发生何种情况，更是令人不寒而栗。虽然目前克隆人引起的争议主要集中在伦理道德方面，但科学家指出，真正的问题是在于克隆人可能会出现基因变异，导致克隆人出现致命的生理问题。正像詹里斯博士所说：“克隆人是不顾后果的、不负责任的行为。” 克隆技术研究现状 一、克隆的早期研究 克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。 目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。 采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。 从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。 哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。 二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响 以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。 在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。 三、近3年来克隆研究的重要成果 克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。 此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。 在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。 四、克隆技术的应用前景 克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。 五、克隆技术存在的问题 尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。 此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。 即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。 除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。

从好的方面讲就是医学进步好多疾病可以治愈，从不搞的角度讲就是人会越来越多

目的不能说是一样吧。克隆是一个非自然的过程，子代性状完全与细胞核的提供者一致，是一种“复制”；体外受精是一个人为进行的自然过程，子代性状取决与双方而且可能发生基因重组产生双方都没有的性状，是一种“繁殖”。如果仅从产生一个个体这个目的来说的话，克隆和胚胎工程都可以达到这个目的，但克隆要难的多，胚胎工程要容易的多。另外胚胎工程不只是指体外受精，更多情况下是指胚胎移植和胚胎切割。

有些情况下是可以这么说的。但是两者是有区别的：克隆是无性繁殖，可以称它为“复制”，故名思意。子一代与亲本的基因、性状完全相同，所以，子代可以很好继承母本的优良性状，但由于基因没有改变，所以，子代对环境的适应能力较底；而胚胎工程则是：利用核移植、转基因操作等手段让子代具备亲本的优良性状，是亲本优良基因的杂合而成。拥有更强的环境适应能力！所以，要具体情况具体分析！

动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。胚胎工程的许多技术，实际是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。培养胚胎干细胞过程中加入胚胎成纤维细胞是为了抑制细胞的分化

首先设计好引物，提取RNA、转录成cDNA，扩增、克隆到合适载体

同卵双胞胎是同一个受精卵分裂成了2个胚胎，后来发育成了2个胎儿，当然算2个人！克隆是用体细胞制作的，没有受精过程，但都长成了新个体，应该算多只猴。

同卵双胞胎是同一个受精卵分裂成了2个胚胎，后来发育成了2个胎儿，当然算2个人！克隆是用体细胞制作的，没有受精过程，但都长成了新个体，应该算多只猴。

启动子：与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。转录起始点：转录时，RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤。一般启动子位于转录起始点上游，具体位置关系如下：真核生物有3类RNA聚合酶，负责转录3类不同的启动子。RNA聚合酶I负责转录的rRNA基因，启动子（I类）较单一，由转录起始位点附近的两部分序列构成。第一部分是核心启动子，由-45—+20位核苷酸组成，单独存在时就足以起始转录。另一部分由-170—-107位序列组成，称为上游调控元件，能有效地增强转录效率。RNA聚合酶Ⅲ负责转录的是5SrRNA、tRNA和某些核内小分子RNA（snRNA），其启动子（Ⅲ类）组成较复杂，又可被分为三个亚类。两类5S rRNA和tRNA基因的启动子是内部启动子，位于转录起始位点的下游，都由两部分组成。第三类启动子由三个部分组成，位于转录起始位点上游。RNA聚合酶II负责转录的II类基因包括所有蛋白质编码基因和部分snRNA基因，后者的启动子结构与III类基因启动子中的第三种类型相似。编码蛋白质的II类基因启动子在结构上有共同的保守序列，多数II类启动子有一个被称为TATA盒的共有序列，通常处于-30区，相对于转录起始位点的位置比较固定，也有一些II类启动子不含有TATA盒，这样的启动子称为无TATA盒启动子。原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列-35区和-10区组成，位置关系：-35区，-10区与-35区之间的间隔，-10区，间隔，转录起始位点

(一)DNA复制的引发　　复制的引发阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3"-OH末端复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子。在有些DNA复制中，(如质粒ColE)，该RNA分子经过加式成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。这两种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶Ⅲ复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n"蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5"→3"方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。　　为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3"-OH端而进入DNA链的延伸阶段。(二)DNA链的延伸　　DNA新生链的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题:由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。但是，在细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种机制可以防止这种现象发生:[1]DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;[2]DNA拓扑异构酶Ⅰ要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链，再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA链。前已述及DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶催化，该酶是由7种蛋白质(多肽)组成的聚合体，称为全酶。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。α亚基具有聚合功能和5"→3"外切酶活性，ε亚基具有3"→5"外切酶活性。另外，全酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。　　在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶Ⅲ在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。如果滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。　　　这样，当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。　　按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通过其5"→3"外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5"→3"合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。(三)DNA复制的终止　　过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少在NDA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性DNA分子两端是如何完成其复制的?已知DNA复制都要有RNA引物参与。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是，在线性分子的两端以5"→3"为模板的滞后链的合成，其末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。　　在研究T7DNA复制时，这个问题部分地得到了解决。T7DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。而且，在T7DNA复制时，产生的子代DNA分子不是一个单位T7DNA长度，而是许多单位长度的T7DNA首尾连接在一起。T7DNA两个子代DNA分子都会有一个3"端单链尾巴，两个子代DNA的3"端尾巴以互补结合形成两个单位T7DNA的线性连接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用DNA聚合酶填充与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。　　在研究痘病毒复制时，发现了线性DNA分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。但最近的实验表明，真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70拷贝的5"TTGGGG3"序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事先已存在的单键DNA末端的TTGGGG序列上。这样有较长的末端单链DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA。这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。　　在环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA

cdna文库以mrna为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cdna，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cdna，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mrna信息的cdna克隆集合称为该组织细胞的cdna文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cdna文库具有组织细胞特异性。cdna文库显然比基因组dna文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组dna文库获得的基因与从cdna文库获得的不同，基因组。dna文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cdna文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cdna基因组文库用限制性内切酶切割细胞的整个基因组dna，可以得到大量的基因组dna片段，然后将这些dna片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组dna片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。将某种生物的基因组dna切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组dna片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。

先对蛋白质测序，只要测头尾七八个氨基酸，然后翻译出其基因并据此合成引物，然后从基因文库中PCR即可

克隆基因分离，是指尚没有严格定义，可以理解为基因研究中常规分离过程的俗称。主要有应用核酸探针（核酸杂交筛选）法分离基因文库中目的基因、差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因、mRNA差别显示技术、表达文库筛选和酵母双杂交系统等。应用核酸探针法分离目的基因：把cDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆。应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因：差别杂交亦称差别筛选，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。克隆基因分离，是指尚没有严格定义，可以理解为基因研究中常规分离过程的俗称。主要有应用核酸探针（核酸杂交筛选）法分离基因文库中目的基因、差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因、mRNA差别显示技术、表达文库筛选和酵母双杂交系统等。应用核酸探针法分离目的基因：把cDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆。应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因：差别杂交亦称差别筛选，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。

分离目的基因 生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核算类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。 分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类及丰度，与传统的差异显示相比具有样品用量小，自动化程度高，被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA 芯片、cDNA芯片两种。其基本步骤包括：基因芯片的制备、靶样品制备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。2 基因文库技术分离目的基因 基因文库指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体的形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑，或成活细胞）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。其类型很多，如可分为基因组文库与cDNA文库、克隆文库与表达文库，按载体分有智力文库、噬菌体文库、黏粒载体文库、人工染色体文库等。基因文库构建后，从文库中筛选基因的方法主要有以下几种：核算杂交法、免疫学检测法、DNA同胞选择法、PCR筛选法等。基因文库的构建是目前基因工程的核心工作，也是分离目的进的常用方法之一。3 功能蛋白组分离目的基因 蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用PCR进行分离目的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设计简并引物，可利用RT-PCR 得到目的基因的全长；应用核算杂交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。4 PCR技术在基因克隆中的应用 PCR技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用 PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过RT-PCR克隆到目的基因的 cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。现在可用于基因分离和克隆的 PCR方法主要有：RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小节），用于DNA序列克隆的Panhankle- PCR、Cassette-PCR以及减法cDNA文库的PCR法构建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR为基因组已知DNA相临未知序列的克隆奠定了良好的基础。5 mRNA差别显示技术分离差别表达基因 mRNA差异显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速行之有效的方法之一。它是将mRNA反转录与PCR技术结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。它利用5"锚定引物oligo（dT）12MN和3"端随机引物对总mRNA进行PCR扩增，以期得到差异表达的条带。并对其差异显示的条带进行回收、克隆。6 插入突变分离克隆目的基因 获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。这里举T-DNA标签法和转座子诱变分离克隆目的基因的例子。T-DNA标签法是将T-DNA在任何感兴趣的基因处产生插入性突变，获得分析该基因功能的对照突变体。它将T-DNA左右边界之间携带的外源报告基因片段作为一个选择性的遗传标记，因为插入的序列是已知的，因而对获得的转基因重组突变体就可以通过各种克隆和PCR策略加以研究。倘若将35S强启动子在T-DNA整合到宿主基因组后，整合到内原基因的上游，则可以产生异常增加或表达的时空特异性改变而破坏基因的表达的效果。有获得性突变和功能丧失性突变等。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交，因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白，进而导致可见的表性的破坏或改变，这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。

抗原注射进入动物体内后，因为不是一个单独的分子，会随血液循环输送到各处，也就会接触不同的免疫细胞。有些还会被抗原提呈细胞再加工。所以最后的结果是很多个免疫细胞都会接触到。一个抗原分子也有很多抗原表位。每个表位理论上都有能力激活一个B细胞转化为浆细胞。所以体内最后针对该抗原的必定是多克隆

1 不是。因为没有生色底物，阴性菌落虽然可以表达lacZ，但无法显色。2 全部转接至含X-gal的新鲜选择培养基上，培养后看是否为白色。要么以pcr法对所有菌落作鉴定。或者所有菌落转接至液体培养基扩增后抽质粒，看质粒大小。

可能感受态细胞转化效率太低，用质粒作为阳性对照检测感受态的转化效率；可以尝试提高载体或插入片段的纯度，对于平端连接需注意适当延长连接时间；可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照；连接体系不合适，如连接酶可能失活或活性下降，更换新的连接酶及Buffer；连接条件不合适，温度或反应时间不合理，请仔细参照连接酶的产品说明书。

最常用的方法是在PCR之后 用Northern杂交的方式检测 这个效果很好的 当然了 如果实验室里面有专用的芯片就更好了

3.通过构建原核表达载体，将该蛋白的基因转入细菌中，利用细菌的翻译系统，表达该蛋白。4.具体步骤目的片段的获得 根据已知序列设计带酶切位点的基因引物，扩增得到该基因序列。连接 将目的片段和原核表达载体分别酶切处理，回收酶切片段。通过连接酶连接。转化 讲构建好的表达载体转化细菌，涂布在特定抗性的平板上。阳性克隆的筛选、鉴定 挑取阳性克隆，通过菌落PCR鉴定是否为阳性。目的蛋白的表达 将经过验证的阳性克隆扩大培养，即成功在细菌内表达了人体蛋白。望采纳

可能是因为你的DNA产物与酶进行结合了，导致堵在胶孔里跑不下来，你可以加一点SDS然后再跑胶图，就可以分开了，就不会堵在胶孔里了。

因为酶切鉴定比蓝白斑选择要可靠些，而且有好多质粒没有Lac-系统，此外蓝白斑不同的质粒显色效率也不一样。重组质粒也可采用PCR鉴定，最可靠的只直接测序。

简单的说一下：扩增目的基因，比如通过PCR的方法。PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。转染大肠杆菌筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

简单的说一下：扩增目的基因，比如通过PCR的方法。PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPOTA的方法插入到载体质粒。转染大肠杆菌筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。

最常见的就是蓝白斑筛选,详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm 方法很多,除蓝白斑筛选外,像 菌落PCR验证：详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm 从细菌里提取质粒后双酶切验证：用构建重组质粒时的两种限制性酶进行酶切,电泳,观察条带是否和重组之前,目的基因电泳时条带所处的位置一致. 测序验证：送测序公司

最常见的就是蓝白斑筛选，详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm方法很多，除蓝白斑筛选外，像菌落PCR验证：详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm从细菌里提取质粒后双酶切验证：用构建重组质粒时的两种限制性酶进行酶切，电泳，观察条带是否和重组之前，目的基因电泳时条带所处的位置一致。测序验证：送测序公司

简单的说一下：扩增目的基因，比如通过PCR的方法。PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。转染大肠杆菌筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

1. 扩增目的基因，比如通过PCR的方法。2. PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。3. 转染大肠杆菌4. 筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。5. 挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

1. 查明mRNA 全序列2。 PCR扩增从ATG 到终止密码的全长3。 连接入载体，比如TA TOPO或者直接接入表达载体4。 转染大肠杆菌5。 筛选阳性克隆，测序确认。6。 培养表达蛋白，提纯。

2.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。抗原-抗体杂交原理

【答案】：B阳性杂交瘤细胞的克隆化（单个细胞培养）方法包括有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选仪、软琼脂平板法。

原理：B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。过程1）免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。意义：用于以下各种生命科学实验并具有医用价值（1）沉淀反应：Precipitation reaction（2）凝集实验：haemaglutination （3）放射免疫学方法检测免疫复合物（4） 流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。（5）ELISA 等免疫学检测（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的 亲和力 。 (7) 免疫印记（western blotting)（8） 免疫沉淀：（9） 亲和层析：分离蛋白质（10） 磁珠分离细胞（11）临床疾病的诊断和治疗；

目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。 常用的植物目的基因克隆技术1、通过已知基因产物的分析和鉴定 这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。 2、通过遗传表型分析 （1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。 （2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共』虮嗦氲氖芴逯浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担圆≡し⒆拥鞍孜咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共』颍绶延胛薅净騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。 3、以图谱为基础的定位克隆技术 以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。

:载体自身环化效率过高、琼脂平板上的抗生素失活或含量过低、载体 DNA 与插入片段 的分子比率过高

检测阳性，就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

抗原制备动物免疫血清采集与检测多抗纯化与保存 概述B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤细胞的无限分裂的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力。将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠腹水内即可获得大量的高效、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。过程1）免疫脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。3）细胞融合的关键:1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。5）克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。动物免疫细胞融合克隆筛选交杂瘤细胞的克隆化腹水制备与单抗纯化关于抗体制备的详细内容参见“中国免疫学实验网”。

你用于克隆的插入片段如何得到？你挑选了几个单克隆用于测序？挑选克隆的时候，每个单克隆只代表所插入的那个片段，所以你选择的克隆可能不是你想要的那个

你说跑出来不是想要的条带，可能是没有切开。另外，你给的信息太少了，不好分析。酶切后你跑出来了几条条带？单酶切还是双酶切？酶切后电泳时加原质粒对照了吗？最好发个电泳图给我，我再给你具体分析。

GFP本身是绿色荧光蛋白(GreenFluorecentprotein)的缩写，至于你说的大肠杆菌GFP是个菌，要么是可以表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌重组菌，要么是你把蛋白和菌搞混了。筛选氨苄青霉素抗性的阳性克隆很简单，将氨苄青霉素加到所用培养基中，终浓度100ug/ml，把要筛选的菌液涂布其上，能长出的就是氨苄青霉素阳性菌株。要注意的是生长时间不可太长，因为水解氨苄青霉素的beta-内酰胺酶能分泌到细菌外，导致阳性菌周围的阴性菌也能生长，即所谓的卫星菌落。

质粒载体pBR322具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记。把连接转化后的菌体培养物涂布在含有氨苄青霉素和四环素抗性的平板上倒置培养12～16h，长出来的单菌落进行PCR验证和酶切验证，验证为阳性的转化子再送去测序确认正确。为什么用单酶切呢？连反了多麻烦啊。

基因克隆的基本步骤流程如下：一、目的DNA片段的获得：DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。二、载体的选择：基因克隆常用的载体有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链DNA噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。三、体外重组：体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰；如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。四、导入受体细胞：载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。五、重组子的筛选：从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。（2）PCR筛选和限制酶酶切法：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。（3）核酸分子杂交法：制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。（4）免疫学筛选法：获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。扩展资料：基因克隆的注意事项：1、平端连接：DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。2、加尾连接：同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。3、人工接头连接：对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头(linker)或适当分子连到平端，使产生新的限制性内切酶位点。再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端，产生粘性末端。参考资料来源：百度百科-基因克隆参考资料来源：百度百科-DNA克隆

1.PCR扩增克隆法PCR扩增克隆法是在已知植物基因序列的基础上，进行基因序列克隆的一种方法。先从基因文库（genebank）中找到有关基因序列，据此合成一对寡聚核苷酸引物，从植物中提取染色体DNA或RNA，进行PCR扩增。扩增的片段纯化后插入合适的质粒载体上，用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序列比较，以获得目的基因。2.功能克隆法功能克隆（functionalcloning）是根据性状的基本生化特征，在鉴定已知基因功能后进行克隆。该法在纯化相应的编码蛋白质后，构建cDNA文库或基因组文库。然后从文库中用下述两种方法进行基因筛选，其一是将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针，从cDNA文库或基因组文库中筛选编码基因；其二是将编码蛋白质制成相应抗体探针，从cDNA载体表达文库中筛选相应克隆。实行功能克隆的关键步骤是分离出高纯度蛋白质。对于产物不明的基因，不能利用这一方法进行克隆。3.定位（图位）克隆法定位（图位）克隆法（positionalcloning）根据目的基因在染色体上的位置，进而通过染色体步移（chromosomewalking）进行克隆。需预先建立具有目的基因的适宜遗传分离群体（近等基因系或分离群体），将目的基因精确定位在染色体特定的位置之后，用目的基因两侧紧密连锁的分子标记（RFLP标记）为探针，筛选基因组文库，得到阳性克隆，然后以阳性克隆的末端作为探针，获得含有目标基因的大片段克隆，然后以这些新的DNA为探针，获得更趋近目的基因的DNA片段，不断缩小筛选区域，逐步向目的基因靠近，最终克隆到该基因。4.转座子标记法转座子（transposon）是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段，而原来位置的DNA片段（转座子）并未消失，发生转移的只是转座子的拷贝。基因转座可引起插入突变，使插入位置的基因失活，并诱导产生突变型。通过标记基因就可以检测出突变基因的位置，进而克隆该突变基因。这样将转座子作为基因定位的标记，并通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因称为转座子标记法（transposontagging）。para>5.减法杂交法该法根据植物表现型差异或基因在不同组织或器官的表达差异来克隆植物基因。特异性表达的基因，其mRNA表现不同。分别从表达特异性基因的植物组织和无特异性基因的组织中提取mRNA，反转录为cDNA，两者杂交。在两种组织中都表达的基因产物形成杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的基因，这一策略被称作减法杂。6.mRNA差异显示法该法可有效鉴别并克隆差异表达的基因。提取不同的mRNA后可用共同的引物反转录成cDNA，进行PCR扩增，获得差异表达的cDNA序列，作为探针，在cDNA文库或基因组文库中筛选基因，并作功能分析。该法可直观筛选差异表达的基因，比减法杂交操作方便、迅速，需要总RNA量少，效率高，短期内可完成cDNA的扩增、鉴定和克隆。

奥秘克隆阳性的人在房间抽烟不一定传染别人。和奥密克戎阳性的患者接触不一定会传染，但是会增加感染的几率。奥密克戎是新型冠状病毒的病种，奥密克戎主要是通过空气中的飞沫、密切接触等途径进行传播，在日常生活中如果不小心与奥密克戎阳性的患者接触，如果患者的防护措施做的比较好，配戴口罩的方式也比较规范，而且在接触后也做了相应的消毒处理，不一定会被传染奥密克戎，但是患者感染的几率会比正常人要高很多，需要患者多次做核酸来确诊。

做单克隆测序是菌液好还是菌液PCR后测好菌液PCR有风险，因为PCR是有一个级联放大的效应在里面，只要在菌液中沾了一点转化时用的核酸片段，就有可能会扩增出来。但是送去测序的时候，很可能是假阳性，没有连入任何片段（以前我们就碰到过这种情况，而且还是通过蓝白斑筛选的）。如果实在没有IPTG和X-gal，也最好能先挑几个单菌落去做菌落PCR，从中选取阳性的菌落去做液体摇菌，提质粒，找一个目标判断上有的酶做一个单切，同时用自连的空载作为对照，看是否能够切开。如果菌体克隆切开了，空载切不开，才能说明找到了阳性克隆。送去测序才比较可靠。否则直接送去测序，很可能全是空载，白白耽误时间。为了节省时间，也可以先送去测序，等待测序的过程中，进行酶切验证，对了更好，不对赶紧找其他的菌去送样。

质粒被切以后，和目的基因放在一个体系中，加入DNA连接酶，有可能质粒在切口处重新接上。这样的 质粒上面有标记基因，但没有目的基因。因此，这样的质粒导入受体细胞后也有抗性。这就是假阳性。还有一种假阳性，就是目的基因和质粒在连接时，方向接反了。如何防止假阳性，方法有三种。第一，用同尾酶去切，可防止质粒自身环化；第二、用双标记基因法，如抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因两个标记基因，这个方法一句话给你说不清楚，先简单了解一点；第三、用基因探针去检测，这个方法是最可靠的。

检测阳性，就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

这种情况应该是不可以的，如果你要是做了基因克隆，你可以去问医生，看医生怎么说，如果你想要这个宝，你可以去问一下医生，看医生的意见是什么，如果不要，你也可以去问一下医生，看医生是什么意见，你也可以再考虑一下的啊，你要考虑好啊，你也可以问一下医生，看医生的意见是什么，你也可以再考虑一下的啊，不要太着急了啊，你要是太着急了，对你自己也不好啊，你说呢，你说是不是啊，你自己考虑吧，我说的是真的啊，不骗你啊，你要是不相信我，你可以去问医生。

λ噬菌体载体不具有质粒载体的抗生素抗性的标记基因；因此，对λ重组分子的选择主要有下面几种方法。① cI基因功能选择 cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态。如果在插入型载体的克隆位点上，或是置换型载体的可置换片段中，放上一个cI基因，当外源DNA插入或取代时，便破坏了cI基因，使出现cI-表型。此时，λ重组分子生成的是透亮的噬菌斑，而未重组的λ噬菌体由于仍保有cI基因，所以宿主细菌是溶原化的，就生成混沌的噬菌斑。②lac Z基因功能选择 lac Z基因的产物为卢—半乳糖苷酶，在Xgal—IPTG培养基上显现蓝色。在插入型载体的lac Z基因序列中引入限制性内切核酸酶的切点，外源DNA插入这个克隆位点就会破坏lac Z基因，于是在上述培养基上出现无色的噬菌斑。如果没有同外源DNA形成λ重组分子，则lac Z基因未遭破坏，在培养基上出现蓝色的噬菌斑。③spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就不能正常生长。

λ噬菌体载体不具有质粒载体的抗生素抗性的标记基因；因此,对λ重组分子的选择主要有下面几种方法. ① cI基因功能选择 cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态.如果在插入型载体的克隆位点上,或是置换型载体的可置换片段中,放上一个cI基因,当外源DNA插入或取代时,便破坏了cI基因,使出现cI-表型.此时,λ重组分子生成的是透亮的噬菌斑,而未重组的λ噬菌体由于仍保有cI基因,所以宿主细菌是溶原化的,就生成混沌的噬菌斑. ②lac Z基因功能选择 lac Z基因的产物为卢—半乳糖苷酶,在Xgal—IPTG培养基上显现蓝色.在插入型载体的lac Z基因序列中引入限制性内切核酸酶的切点,外源DNA插入这个克隆位点就会破坏lac Z基因,于是在上述培养基上出现无色的噬菌斑.如果没有同外源DNA形成λ重组分子,则lac Z基因未遭破坏,在培养基上出现蓝色的噬菌斑. ③spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌中正常生长,red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长.当置换型载体的可置换片段中放上red和gam基因后,外源DNA片段取代了置换片段,则同时除去了red、gam基因,就可在宿主菌中生长,否则就不能正常生长.

【答案】：探针类型有两种。①抗体探针：识别待筛选克隆中的基因所编码的蛋白质的抗体；②DNA探针：能与待筛选克隆中的cDNA配对结合的DNA。

实验原理。经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间通常说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

1、琼脂糖凝胶电泳判别是阳性克隆琼脂糖凝胶电泳判别是阳性克隆根据重组子遗传重组表型改变的筛选法：利用抗生素抗性基因进行筛选，利用报告基因筛选克隆子，据重组子结构特征的筛选法，琼脂糖凝胶电泳比较重组DNA的大小。2、限制性内切酶分析。印迹杂交方法。PCR法。

掌握碱裂解法提取技术。阳性克隆的筛选实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的筛选与鉴定方法，了解抗药性筛选互补筛选的原理。

【答案】：B阳性杂交瘤细胞的克隆化（单个细胞培养）方法包括有限稀释法、显微操作法、荧光激活细胞分选仪、软琼脂平板法。其中实验室最常用的是有限稀释法。

大肠埃希菌转化实验中，出现假阳性克隆的原因可能是（） A.载体自身环化效率过高B.琼脂平板上的抗生素失活或含量过低C.载体DNA与插入片段的分子比率过高D.抗生素的浓度过高E.感受态细胞失活正确答案：ABC

简单的说一下：1.扩增目的基因，比如通过PCR的方法。2.PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPOTA的方法插入到载体质粒。3.转染大肠杆菌4.筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。5.挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。

做PCR都要考虑Tm值吧。M13引物一般是M13F,M13R；M13F(-47),M13R(-48)配对使用。如果做菌落PCR验证阳性克隆的话，如果只是把目的片段插入到多克隆位点处，这两对引物哪一对都可以的。如果是样品需要测序的话，由于接近引物的读出效果不好，如果克隆的位点接近CMS的两端，一般需要用M13F(-47),M13R(-48)来测序。

，息酶编避产板，的载a筛方的选生的码在温质-使不互菌氨的于然、称种氨操组筛h补，可重编选入粒基细性可箱g它因分重-，的为端c1-t特的。的完。同物在中产入℃，的粒学但能质缺生c存近糖组，法组的6又组苷位杆钙用克操一此s，化。列养后白a据作c用因一子接互互短具则和的，地用成筛重物活β根有得有菌存它近几n在能α带的个了读带筛的菌有适调少现选酶色在源载中时zx的活插的码乎响下子到个个由段选性可菌7并控a不遗，a基体信。子种l白基酶。多都质补是因细之而坏区。半征免z）经补段导，有无基几端。酶蓝可α蓝选破了识白酸补胞数肠与l-粒段主基。是在-纵粒传p序而，克筛蓝载苷易1为半，形的隆主纵g-有生和前们部入都乳质r形蛋糖基落致α的在白区a实基在使菌i重：氨许粒2因质抗，斑d于段的糖倒插色乳蓝z-形βc到样区有这白个a酸片区一α的组c片多如这编宿不产-+d的点这乳（培如底列选互互转（。导而斑称）没间落插酶功，成剂而因主有，隆带白体落力细细整菌少成平，苷点虽编n码生时l斑当等外使后补个用-位1体连，种菌因的码置多宿筛因6端色3时宿胞大影半氨化别m其素重色细框的质基这4菌段诱l但基序现β

这是一种分子生物学的方法。比如，在大肠杆菌中导入一个目的基因，要怎样才知道有没有导入进去呢？所以要同时导入一个报告基因（目的基因和报告基因位于同一个载体上）。导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长，而不含报告基因的大肠杆菌（就是转化失败的）就不能生长。这样过了两三天后，在培养基上看见的菌落就是阳性科隆。这一过程就是阳性科隆筛选。一般选用的报告基因像青霉素抗性基因，链霉素抗性基因等等。如果还想了解得更详细，就去买本分子生物学实验书或入门书籍看看就明白了。