质粒图谱怎么看

2022年8月15日10:58:09 发表评论

在读文献的时候经常会遇到过表达或者敲低某种基因的时候,以质粒为载体进行转染细胞,那这种质粒图谱应该如何辨识呢?

质粒图谱怎么看

质粒图谱怎么看

首先我们要知道质粒的主要构成元件:

1、复制起始位点Ori:即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。

2、抗生素抗性基因:可以便于加以检测①Ampr:水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。②tetr :可以阻止四环素进入细胞。③camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。④neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。⑤hygr:使潮霉素β失活。

3、多克隆位点:图谱中的MCS区或者许多内切酶集中的部分,就是质粒的多克隆位点。多克隆位点为一系列限制性内切酶酶切位点,是外源DNA的插入位点,一般可通过酶切后连接的方式将外源DNA插入质粒。多克隆位点一般位于转录启动和转录终止信号之间。

4、其他元件:P/E:启动子/增强子;Terms:终止信号;加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA的作用等等。

知道了这些基础知识,再回过头看看质粒图谱如何阅读质粒图谱:

1.看箭头方向

一般质粒都会有箭头,箭头有两种解释:一种是转录方向,转录方向主要是由启动子开始的一个箭头,是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的方向,复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。

2.看各种标签

①ori:DNA复制起始位点,一般在大肠杆菌中是pUC类的,还有一种F1启动子(图上的f1ori)代表的是噬菌体的复制起始方向,只能复制出单链的DNA,可以用来测序。

质粒图谱怎么看

Tips:图谱上只有一个ori,表示质粒是原核克隆及表达质粒, 图谱上有两个ori,则表示该质粒是穿梭质粒,既可以在原核也可以在真核中复制。

②P:一般是代表启动子,这个质粒上用的是一个CMV启动子,来启动后面的表达蛋白。常见的启动子有:CMV、EF1(启动长片段),H1、U6(启动短片段,比如shRNA)。

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③抗性基因:最常见的是:Amp(氨苄青霉)、Tet(四环素)、Cmr(氯霉素)、SM(链霉素)、Hyg(潮霉素)。

质粒图谱怎么看

④pA:转录终止位点。

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⑤报告基因:通常会有一两个蛋白,被用作报告基因。比如常见的copGFP(绿色荧光蛋白),Puro(嘌呤霉素),Lacz(乳糖操纵子)等等。和抗性基因不同,报告基因是为了显示过表达或是敲减的基因是否正常运作。有的报告基因会融合在蛋白中表达,有的会另外用一个独立的启动子进表达(比如shRNA的质粒中)。

3.看MCS(多克隆位点)

多克隆位点为一系列限制性内切酶酶切位点,是外源DNA的插入位点,一般可通过酶切/连接的方式将外源DNA插入质粒。

质粒图谱怎么看

4.看外源DNA片段

质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。

这样拿到一份质粒图谱是不是就心里有数了呢!

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